Лабораторная диагностика африканской чумы свиней

Лабораторная диагностика африканской чумы свиней

Диагностика Африканской чумы свиней

Диагноз на африканскую чуму свиней ставят комплексно на основании анализа эпизоотологических данных, результатов клинических, патологоанатомических и лабораторных исследований.

Лабораторную диагностику АЧС проводят специализированные ветеринарные лаборатории по особо опасным инфекционным болезням животных или научно-исследовательские учреждения, имеющие аккредитацию на работу с возбудителями особо опасных инфекций (ГНУ «ВНИИВВиМ», г. Покров; ФНУ «ВНИИЗЖ», г. Владимир).

Предварительный диагноз на АЧС может быть поставлен на основании анализа клинико-эпизоотологических данных и патологоанатомических исследований.

Основанием для подозрения АЧС может служить возникновение заболеваний с быстрым течением и высокой смертностью среди свинопоголовья, привитого против классической чумы свиней.

Сходство клинических и патологоанатомических признаков классической и африканской чумы свиней затрудняет постановку диагноза.

В отличие от возбудителя классической чумы вирус АЧС имеет многообразие в антигенном и иммунологическом отношениях, гемадсорбирующие и негемадсорбирующие штаммы, что значительно усложняет постановку диагноза.

Возбудители АЧС и КЧС вариабельны и по вирулентности в природе выделены штаммы вируса, вызывающие различные формы и течения болезни — сверхострое, острое, подострое, хроническое бессимптомное с летальностью от 10 до 100%, встречаются и природноослабленные, авирулентные штаммы.

Поэтому дифференцировать АЧС на основании клинико-эпизоотологических данных и патоморфологических изменений чрезвычайно трудно, необходимо прибегать к лабораторному анализу.

Методы выделения вируса и выявления антигенов:

Экспресс-метод обнаружения вируса.

Индикация и идентификация вируса.

Выделение и индикация вируса в культурах клеток.

Методы выявления антител (серодиагностика и ретроспективная диагностика):

Непрямая иммунофлюоресценция антител (НИФ).

Твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА, ELISA).

Встречный иммуноэлектросмоофорез (ВИЭОФ).

Из клинических симптомов следует учитывать высокую постоянную лихорадку в течение 3-6 дней, угнетение, нарушение гемодинамики, посинение кожи, ушей, живота, симптомы отека легких, диарею иногда с кровью, кровянистые истечения из ротовой и носовых полостей. Болезнь заканчивается летально в течение 2-6 дней. Клинические признаки не характерны и весьма сходны с таковыми при классической чуме. Из патоморфологических изменений следует выделить увеличение селезенки в 1,5-2 раза, серозно-геморрагическую пневмонию со студневидно желатинозным отеком междольковой соединительной ткани, полнокровие почек с множественными кровоизлияниями, геморрагическую инфильтрацию портальных, мезентериальных, почечных и других лимфоузлов, скопление большого количества серозно-геморрагического инфильтрата в грудной, брюшной и перикардиальной областях и отек желчного пузыря. Наличие трех и более признаков у нескольких животных дает основание на подозрение заболевания свиней африканской чумой.

При дифференциальном диагнозе исключают классическую чуму, пастереллез, рожу и болезнь Ауески. Наиболее сложно отличить первые две болезни, так как клиническое проявление у них очень сходное (таблица).

Африканская чума свиней — АЧС

Африканская чума свиней (сокращенно АЧС) является высоко заразительной болезнью, которая проявляется у животных в виде лихорадки, геморрагического диатеза, воспалительных процессов в организме, дистрофических и некротических признаков в различных органах. Заболевание имеет высокий процент смертностиживотных (до 98-100%).

Свиная чума считается сравнительно новым заболеванием. Была введена в 1921 году английским исследователем Р. Монтгомери (другое название этой чумы — «Болезнь Монтгомери»). А первые описания АЧС были сделаны незадолго до этого: в нескольких областях Южной Африки в период с 1903 по 1905 годы.

Что такое африканская чума свиней

Заболевание — африканская чума свиней — является вирусным. Его возбудитель — двадцатигранный цитоплазматический ДНК с представителем иридовирусов. Это сложный многоструктурный вирус, который накапливается во всех органах больного животного, проникая даже в клетки костного мозга и крови (в лейкоциты).

Вирус АЧС имеет очень высокую устойчивость и способен до полугода выживать, находясь в почве, на деревьях и даже на кирпичах! Также этот вирус может обитать в сыром мясе, костном мозге животных и остается в тех местах, где находились зараженные животные, то есть в свинарниках. Вирус практически не боится таких дезинфицирующих средств как формалин и щелочь, поэтому дезинфекция осуществляется посредством хлорсодержащих веществ, а также различных кислот и окислителей (уксусная, молочная, карболовая кислоты).

Объекты заражения африканской чумой свиней и пути передачи (эпизоотология)

Африканская чума опасна для диких и домашних свиней любого возраста. При этом наиболее тяжело заболевание переносят породы европейских животных. В то время, как непосредственно африканские свиньи переносят заболевание без каких-либо симптомов.

Читайте также:  Как приготовить мятный сироп в домашних условиях

Основной способ заражения АЧС — это уже заболевшие, а также переболевшие животные. При этом даже после выздоровления животного вирус сохраняется в организме до двух и более лет. Заражение происходит при нахождении животных в непосредственной близости друг к другу. Также вирус может проникнуть в ранку на коже, а еще его переносят клещи.

Распространение на географической территории происходит через транспорт, рабочий инвентарь для обслуживания животных, воду, навоз и так далее. Повышенную опасность имеют продукты убоя зараженных животных и пищевые и боенские отходы.

Вирус АЧС переносят люди, другие виды животных и насекомые.

Основным источником возбудителя заболевания являются дикие африканские свиньи. В странах Европы и США вирус переносят аргасовые клещи, сохраняющие его в своем организме на многие годы.

Вспышки африканской чумы возможны в любое время года, однако периодом особого риска является вторая половина лета и первая половина осени. Периодичность возникновения крупных очагов вируса в Европе составляет около пяти лет.

Диагностика АЧС

Диагностику африканской чумы свиней производят комплексно, основываясь на анализе эпизоотических показателей, клинических результатах, патологоанатомических сведениях и лабораторных исследованиях.

Лабораторную диагностику выполняют специальные аккредитованные учреждения и ветеринарные лаборатории, специализирующиеся на особо опасных инфекционных заболеваниях животных.

В России лабораторные исследования по идентификации африканской чумы производят Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии в Покрове и Федеральный центр охраны здоровья животных во Владимире.

Методы лабораторной диагностики африканской чумы свиней в соответствии с ГОСТ 28573-90

В России разработаны современные средства и методы лабораторной диагностики африканской чумы свиней. Во Всероссийском научно-исследовательском институте вирусологии и микробиологии предложены схемы и методы индикации (обнаружения) возбудителей этих болезней в объектах ветеринарного надзора и окружающей среды на основе достижений молекулярной биологии и генной инженерии.

Диагноз на АЧС устанавливается следующими лабораторными методами:

— Метод прямой иммунофлуоресценци и (РПИФ). Определение антигена вируса в мазках-отпечатках реакцией прямой иммунофлуоресценции на базе микроскопа Olympus CX41 в специальной комплектации.

— Молекулярно-биологический метод (ПЦР) с детекцией в электрофорезе с детекцией в режиме «реального времени». Определение генома вируса африканской чумы свиней в пробах органов, в крови животных методом полимеразной цепной реакцией (ПЦР).

— Метод иммуноферментного анализа (ИФА). Прижизненная диагностика – выявление специфических антител всыворотке крови больных животных методом иммуноферментного анализа.

Статистические параметры диагностической работы ПЦР и РПИФ, основанные на использовании сложного проекта стратифицированной выборки тест-популяции первично инфицированных домашних свиней и диких кабанов от полевых случаев или вспышек африканской чумы.

Рубрика Сельское, лесное хозяйство и землепользование
Вид статья
Язык русский
Дата добавления 21.02.2016
Размер файла 30,2 K

Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже

Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Диагностические оценки ПЦР и РПИФ при использовании выборки от полевых вспышек африканской чумы свиней

В статье представлены статистические параметры диагностической работы ПЦР и РПИФ, основанные на использовании сложного проекта стратифицированной выборки тест-популяции первично инфицированных домашних свиней и диких кабанов от полевых случаев или вспышек африканской чумы свиней (далее, АЧС). В результате непарных ПЦР-тестирований 1 220 домашних свиней (405 страт) положительными были 1 140 голов (93,4%), а из 519 голов диких кабанов (222 страт) — 471 (90,8%); из проверенных РПИФ 987 голов домашних свиней (364 страт) положительными были 969 голов (98,2%), а из 416 диких кабанов (178 страт) — 358 голов (86,1%). Обследование тех же самых страт при параллельных проверках парных выборок оценки МсNemar’s теста не представили значимых различий между ПЦР — 98,3% и РПИФ — 98,2 % (р=1,0). Это свидетельствует о случайности ложно-отрицательных результатов ПЦР при непарном тестировании, то есть неуверенности, вызванной эффектом эмпирического фактора в проекте выборки. При исследовании парных проб от павших от АЧС кабанов были хотя и незначительные, но различия чувствительности ПЦР и РПИФ — 2,64(0,18-4,4)%, (Р=0,01), которые статистически ещё более выражены при тестировании случайной выборки отстрелянных кабанов — 6,99 (1,6-10,5)% Р=0,01. ППР величины при параллельном выполнении системы "ПЦР-РПИФ" были достоверно высокими для подтверждения инфекции АЧС, от 95,7 (86,0-98,4)% при превалентности 10 (3-24%) в крупных стадах до 99,2 (98,5-99,5) % и 99,6 (99,3-99,7)% — в средних и мелких (превалентность 37,0% и 53%, соответственно). кабан чума африканский

Читайте также:  Запеканка из кабачков и грибов в духовке

Практически, параллельная система "ПЦР-РПИФ" имеет хорошую достоверность и воспроизводимость для подтверждения клинических случаев АЧС в любых стадах (фермах) домашних свиней и кабанов, не требующая подтверждения положительных результатов референс-методом.

Ключевые слова: африканская чума свиней, вспышка, лабораторная диагностика, выборка, тесты, полимеразная цепная реакция, реакция прямой иммунофлуоресценции, параллельное тестирование, прогностические положительные результаты, прогностические отрицательные результаты.

Основной особенностью семилетнего развития эпизоотического процесса АЧС в сильно структурированном свиноводстве Российской Федерации является наблюдаемая периодичность его активных фаз (эпизоотий) с короткими межэпизоотическими периодами с низкой или очень низкой месячной инцидентностью вспышек (спорадические случаи) как в стадах домашних свиней, так и популяциях диких кабанов. Инфекция АЧС всегда сопровождалась геморрагическим воспалением, коротким инфекционным периодом (5-7 дней) с последующим фатальным 100% исходом [1], что свидетельствует о высокой вирулентности вируса [1, 8, 9].

Сразу же, после интродукции вируса АЧС на территорию РФ, для подтверждения инфекции использовали лабораторные методы по ГОСТ 2857-90 "Свиньи. Методы лабораторной диагностики африканской чумы свиней" [3, 10]. Рекомендованные методы предназначались для диагностических исследований АЧС при острой (изоляция вируса с использованием культуры макрофагов in vitro и феномена гемадсорбции, реакция прямой иммунофлуоресценции, сэндвич ИФА), хронической и латентной формах течения (реакция непрямой иммунофлуоресценции, непрямой иммуноферментный анализ). Ранее, хорошая диагностическая эффективность этих реакций была признана экспертами МЭБ при ликвидации АЧС в Европе и Латинской Америке в 20 веке [13, 15]. Исторически, в РФ для указанных методов реагенты и наборы препаратов были разработаны ещё в 70-80 годы прошлого столетия [2, 7], но имели статус валидированных только на основании использования выборки от экспериментальной инфекции АЧС. Первая публикация относительно ПЦР, как диагностического метода, была в 1992 году [14], а в РФ — в 1995 году [11]. Позднее, после усовершенствований, в практику диагностики АЧС была введена ПЦР в реальном времени [12], но вопросы валидации ПЦР (варианты электрофорезного и в реальном времени) практически были освещены очень ограниченно [4, 5, 6].

В связи с перманентным развитием эпизоотической ситуации, основной интерес властей к лабораторным исследованиям был основан, прежде всего, на необходимости быстрого подтверждения подозрения на АЧС. Благодаря активному влиянию госветслужбы, были организованы централизованные государственные закупки диагностических средств и оборудования, тренинг практических ветеринарных специалистов в научно-исследовательских учреждениях страны, поэтому ПЦР, РПИФ и ИФА были очень быстро внедрены в обычную практику ветеринарных лабораторий [9, 10]. С точки зрения объектов обнаружения, рассматриваемые реакции можно считать условно зависимыми (обе реакции обнаруживают вирус) и независимыми, так как на молекулярном уровне ПЦР обнаруживает фрагменты вирусспецифической ДНК, а РПИФ (или ИФА) — вирусспецифические полипептиды. Однако, хорошие научные знания принципа работы реакций и их блестящее техническое выполнение, могут объяснить только механизмы обнаружения компонентов вируса и представлять только свидетельства их обнаружения (то есть продукты амплификации или люминесцентная визуализация вирусных белков). Однако, для достижения основной цели лабораторных исследований — непредубеждённо оценивать полученные результаты реакций и затем делать заключение "болезнь есть" или "болезни нет", требуются очень хорошо выверенные знания диагностических характеристик используемых методов. Поэтому, из-за отсутствия таких данных ветеринарным руководством было принято решение об обязательной перепроверке положительных результатов ПЦР и РПИФ (но не отрицательных), полученных практическими ветеринарными лабораториями на АЧС, в научных учреждениях (ВНИИВВиМ или ВНИИЗЖ).

Таким образом, имея в своём распоряжении данные масштабных лабораторных скринингов большого количества инфицированных АЧС и интактных домашних свиней и кабанов, выполненные ВНИ-ИВВиМ и практическими ветеринарными лабораториями в течение 2008-2013 годов, а также все выборки при вспышках, основной целью исследований было валидация ПЦР и РПИФ и оптимизация схемы выполнения для усиления законности лабораторных исследований на

Читайте также:  Как морозить перец для фаршировки на зиму

Материалы и методы. Для выполнения РПИФ и ПЦР использовали коммерческие серии наборов и реагентов собственного производства:

· "Специфические ФИТЦ-иммуноглобулины АЧС для им-мунофлуоресцентной диагностики африканской чумы свиней" — коммерческие серии ВНИИВВиМ; выполнение РПИФ в соответствии "Инструкции по применению";

· "Тест-система для выявления ДНК вируса АЧС методом ПЦР в реальном времени" — коммерческие серии ВНИИВВиМ.

В практических ветеринарных лабораториях была использована также коммерческая тест-система "АЧС" для выявления генетического материала вируса африканской чумы свиней методом полимеразной цепной реакции (производство ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии).

Учёт результатов реакций был дихотомический (то есть "положительный" или "отрицательный"), несмотря на субъективные оценки по 4-х бальной шкале для РПИФ или инструментальные по Ct- оценкам для ПЦР.

Для индивидуальной оценки диагностических характеристик ПЦР и РПИФ использовали сложную выборку, которая включала полевые экспертизы, сгруппированные в страты, включавших пробы от всех павших домашних свиней или диких кабанов, классифицированные как "референс-положительные АЧС" (на основании опроса и идентифицированные как ПЦР-положительные и/или РПИФ-положительные практическими ветеринарными лабораториями). Так как типы проб были разными (для ПЦР использовали пробы крови/сыворотки, костного мозга, а для РПИФ — в основном, только селезёнки), количества выборок для оценки каждой реакции также были разными.

Выборки "неинфицированных" домашних свиней и диких кабанов были из исторически свободных по АЧС территорий РФ.

Такой тип выборки для парных лабораторных исследований был использован для оценки различий диагностической чувствительности и согласованности реакций. Для этого выборки (п. 1.2.1.) были "нормализованы" по размеру и типу пробы, то есть для оценок реакций от каждого животного выборки отбирали парную пробу селезёнки.

Кроме выборки павших животных, в исследованиях сравнений реакций также использовали парные пробы селезёнок случайной выборки отстрелянных диких кабанов в неблагополучных по АЧС субъектах РФ.

Так как данный проект выборки предназначен для сравнения, размер и структура выборки были для каждой реакции одинаковыми.

При непарных лабораторных исследованиях было последовательное выполнение каждой реакции индивидуально, когда не все пробы могли быть проверены каждой реакцией. Данный проект был предназначен для определения индивидуальных диагностических характеристик ПЦР и РПИФ.

При парных лабораторных исследованиях — параллельное выполнение реакций, то есть тестирование одних и тех же проб ПЦР и РПИФ было предназначено для оценок различий чувствительности и согласованности реакций.

Использовали статистические методы определения величины диагностической чувствительности, диагностической специфичности с использованием таблицы 2*2 [11], различий (МсМетаг’в-статистика) и согласованности (каппа) реакций с использованием пакета программ WinEpiscope 2.0 и Medcalc 10. Для определения прогностических положительных и отрицательных результатов реакций (прогностических характеристик) и эффективности параллельного выполнения использовали данные превалентности АЧС в разных фермах домашних свиней [1] и программу "MultipleDiagnosticTest" пакета WinEpiscope 2.0.

Проект и процесс выборки, осуществляемые на основе использования полевых проб для валидации методов, очень трудны, поэтому требуют описания деталей и пояснения, чтобы дальнейшие интерпретации данных и выводы авторов были понятными. От корректности выборки зависит точность диагностических показателей и рекомендаций относительно стратегии применения лабораторных методов. В наших исследованиях выборки были выполнены практическими ветеринарными врачами при вспышках АЧС в период с 2008 по 2013 годы включительно в 30 субъектах Российской Федерации. Процедуры выборки чаще были от первично инфицированных АЧС павших свиней (целенаправленная выборка), но всегда имели элемент случайности, а также неконтролируемые вмешивающиеся факторы. Поэтому границы терминологии выборки междуэмпирической и случайной установить трудно и потребовалось немало усилий для селекции и приведения проб их в приемлемый статистический порядок. В таблице 1 приведены наиболее общие данные количеств обследованных животных (домашних свиней и диких кабанов) с характеристикой как "инфицированные АЧС", то есть в основной массе они имели клинические признаки болезни, подтверждённые лабораторными исследованиями.

Таблица 1 Размеры положительных АЧС выборок (количества страт и животных по видам), использованные в расчётах для определения диагностической чувствительности ПЦР и РПИФ

Количество АЧС экспертиз (страт)

Количество клинически инфицированных животных* в стратах

Ссылка на основную публикацию
Кудрявая капуста рецепты приготовления
Сливочный суп из кудрявой капусты с зелёными чипсами Предлагаю вашему вниманию лёгкий в приготовлении и полный витаминов супчик из кудрявой...
Красивые клумбы из многолетних цветов готовые схемы
Большинство огородников и садоводов уже давно перестали концентрироваться лишь на выращивании овощных и сельскохозяйственных культур, и решили идти дальше, переключившись...
Красивые мангальные зоны фото
Все, у кого есть загородный участок, наверняка любят отдыхать на нем в свободное время, готовя вкусные блюда на огне и...
Куксу по корейски рецепт
Кукси – блюдо, распространенное в Корее. Также его готовят во многих странах Востока. В настоящее время оно распространилось по всему...
Adblock detector